Подвижные гены
Стало уже привычным, что по мере развития науки возникают те или иные догмы, базирующиеся на твердо установленных фактах. При этом достаточно быстро и неизбежно к существующим фактам добавляется элемент веры в абсолютный характер принятой догмы. Совокупность утвердившихся догм сейчас стало модно называть парадигмой. Однако сам феномен рождения и крушения научных догм был описан еще в начале XX века академиком В. И. Вернадским в его «Очерках по истории современного научного мировоззрения». Становление догмы или крушение ее абсолютного характера в наше время часто сопровождается присуждением
Нобелевской премии или другими знаками отличия, принятыми в научном сообществе.
История, о которой пойдет здесь речь, начинается с работ Томаса Моргана и его школы, сформулировавших в первой четверти этого века постулат о постоянстве расположения генов в хромосомах. За доказательство, в частности, этого постулата Морган и его сотрудники получили Нобелевскую премию. В сороковые годы американская исследовательница Барбара Макклинток получила экспериментальные данные о том, что принцип постоянства размещения генов в хромосомах не абсолютен, что существуют участки хромосом, способные путешествовать из одного места генома в другое. Такое покушение на догму принесло Макклинток — и совершенно заслуженно — тоже Нобелевскую премию — правда, спустя несколько десятилетий после открытия. Почему признание этих работ пришло со столь большим запозданием — разговор особый. Пока можно отметить, что перемещение участков генетического материала из одной хромосомы в другую Макклинток доказала чисто гчетическим методом (тем же, которым пользовался Т. Морган).
Метод генетического анализа состоит в скрещивании организмов и в наблюдении за характером потомства. В наше время сам по себе генетический анализ считается еще недостаточным для утверждения тех или иных представлений о поведении материала наследственности. Лишь после того как открытие Макклинток было подтверждено современными молекулярными методами (в частности, в нашей лаборатории в Институте молекулярной биологии АН СССР), ее работы получили всеобщее признание.
КАК УВИДЕЛИ ПРЫЖКИ ГЕНОВ
В середине 70-х годов двое сотрудников нашей лаборатории, Ю. Ильин и Н. Чуриков, начали работу по клонированию (выделению и размножению) некоторых генов дрозофилы.Целью работ было отобрать среди выделенных генов те, которые активно работают, и изучить их структуру. Объект экспериментов был выбран не случайно. Во-первых, дрозофила изучена генетиками лучше других организмов. Во-вторых, ее аппарат наследственности сравнительно невелик, он в 30 раз меньше, чем у человека. В-третьих, в некоторых случаях клетки дрозофилы перестают делиться, хотя ДНК продолжает в них синтезироваться. В результате в этих клетках появляются гигантские хромосомы, где бок о бок лежат тысячи одинаковых молекул ДНК. На таких хромосомах удается непосредственно выявлять расположение генов.
Ильин и Чуриков выделили несколько активно работающих генов дрозофилы и вместе с Е. Ананьевым (лаборатория В. Гвоздева в Институте молекулярной генетики АН СССР) принялись изучать их свойства. Тут же стало ясно, что гены ведут себя необычно.
По ходу работ требовалось определить, где именно в хромосомах располагаются выделенные гены. Для этого был использован метод гибридизации ДНК. Он основан на том, что разделенные комплементарные цепи ДНК способны найти и узнать друг друга в растворе и соединиться между собой или с другой комплементарной последовательностью
ДНК. Цепи ДНК отобранных для опыта генов разделяли, метили радиоактивной меткой и гибридизировали с ДНК гигантских хромосом. Меченая ДНК находила на хромосомах подобную себе последовательность и связывалась с нею. Покрыв стекло, на котором находились хромосомы, фоточувствительной эмульсией, под микроскопом определяли, с какими именно участками хромосом связалась меченая ДНК — в этих местах при проявлении проступали зерна серебра.
Вот тут и выявилась первая неожиданность. Оказалось, что изучаемые гены разбросаны по разным участкам всех хромосом дрозофилы, то есть они множественны. Между тем большинство обычных генов представлено в геноме небольшим числом копий, а иногда и вообще одной.
Однако самым неожиданным явилось то, что один и тот же ген у разных мушек по-разному локализовался в хромосомах в некоторых случаях координаты совпадали, но в большинстве отличались. У мух разных линий отличия были очень велики, у родственников оказалось больше совпадений, и все же около трети генов одного и того же семейства располагались совершенно вразнобой.
Иными словами, стало ясно, что некоторые гены не имеют определенного места в хромосомах — у разных особей одного и того же вида дрозофил они могут занимать разные позиции. Отсюда следовал вывод, что за несколько десятков или сотен поколений, разделяющих двух родственников, некоторые гены успевали сменить свое местопребывание в геноме.
Эти наблюдения о меняющейся локализации генов были первыми — наша публикация появилась в 1977 г. В лаборатории Д. Хогнесса в Сгэнфордском университете (США) также занимались клонированием похожих участков генома, но лишь двумя годами спустя, в 1979 г., оттуда последовало подтверждение наблюдавшегося нами эффекта.
Мы назвали подвижные участки хромосом «мобильными диспергированными генетическими элементами», или МДГ. Но в ходу и другие термины — такие, например, как прыгающие или кочующие гены. В геноме дрозофилы сейчас открыто около 20 семейств МДГ по 10—150 копий в каждом семействе. Общее число МДГ, следовательно, велико — около тысячи, на их долю приходится примерно 5 % всего генетического материала.
Семейства были пронумерованы: МДГ-1, МДГ-2, МДГ-3, МДГ-4 и так далее. Американские биологи дали им поэтичные названия: copia (копия), gypsy (цыган), HMS Beagle («Бигль» — корабль, на котором плавал Дарвин), гоо (имя кенгуренка Ру из книги о Винни-Пухе)...
Общим у всех МДГ оказалось то, что на концах у них располагаются одинаковые отрезки, называемые длинными концевыми повторами (ДКП). Кочующие гены состоят обычно из 5—10 тысяч нуклеотидных пар, из которых на концевые повторы приходится по 300—600 пар. Концевые повторы играют большую роль в работе этих генов. Под работой гена подразумевается синтез РНК на матрице ДНК. Только так ген может послать сообщение для синтеза кодируемого им белка.
Синтезом РНК или транскрипцией любого гена управляют особые участки — промотор, расположенный в начале гена, и терминатор, размещенный в его конце. Есть еще так называемый усилитель — участок ДНК, который регулирует интенсивность считывания гена.
Так вот, оказалось, что все элементы управления: промотор, терминатор и усилитель — присутствуют в ДКП. Более того, они есть в-обеих цепях ДНК, то есть длинные концевые повторы могут вызвать считывание информации в двух направлениях, по каждой цепи ДНК. И наконец, поскольку аппарат управления расположен на обоих концах МДГ, он может включить в работу не только мобильные элементы, но и соседствующие с ними гены.
ГЕНЫ И ВИРУСЫ
Так устроен прыгающий ген. Его кодирующая ( считываемая) последовательность окружена разными концевыми повторами. ДКП — длинные концевые, КОП — короткие обращенные и КПП — короткие прямые повторы. Однако не все прыгающие гены могут похвастать таким разнообразным окружением. Наиболее просто устроенных «путешественников» сопровождают лишь короткие прямые повторы
Мобильные диспергированные гены распространены повсеместно. Сначала, как уже сказано, их открыли у дрозофил. Вскоре их обнаружили у дрожжей (в работах Р. Дэвиса из Стэндфордского университета), у мышей (Д. Крамеров и А. Рысков в нашей лаборатории). Детальное изучение структуры подвижных генов показало, что они очень напоминают провирусы ретровирусов.
Так устроен прыгающий ген. Его кодирующая и считываемая последовательность окружена разными концевыми повторами. ДКП — длинные концевые, КОП — короткие обращенные и КПП — короткие прямые повторы. Однако не все жрыгающие гены могут похвастать таким разнообразным окружением. Наиболее просто устроенных «путешественников» сопровождают лишь короткие прямые повторы
Ретровирусы — это особая группа вирусов, у которых наследственная информация записана в молекуле РНК, но при попадании в клетку она «переписывается» в ДНК. Для такой перезаписи у вирусов есть соответствующий инструмент — фермент обратная транскриптаза, или ревертаза, которая ведет синтез ДНК по матрице РНК. Синтезируемая таким образом ДНК — это полная копия вирусной РНК; она встраивается в генетический аппарат клетки хозяина и превращается как бы в еще один ее ген. Именно эту вирусную ДНК ретровируса и называют «провирусом». На матрице провируса с помощью клеточных ферментов синтезируется трусная РНК, она становится основой новых яирусных частиц, выходящих из клетки.
К тому моменту, когда мы изучили структуру и транскрипцию мобильных генов дрозофилы, уже было накоплено немало данных о ретровирусах птиц и млекопитающих. Сравнение помогло обнаружить множество сходных черт у МДГ, и провирусы ретровирусов могут прыгать с места на место; у них практически одинаковые размеры; они представлены многими копиями; встречаются в разных хромосомах; несут на концах длинные повторы и часто содержат одинаковые нуклеотидные последовательности. Кроме того, некоторые диспергированные гены могут превращаться в вирусоподобные частицы, которые видны внутри клеток под микроскопом. Совсем недавно мы обнаружили, что МДГ, как и ретровирусы, прыгают с помощью обратной транскриптазы.
Сказанного вполне достаточно, чтобы сформулировать вопрос: что возникло раньше. что из чего произошло — ретровирусы из МДГ или МДГ из ретровирусов? Вполне можно допустить, что некоторые мобильные гены способны существовать в форме вируса. И что, вероятно, существуют переходные формы.
РАЗНЫЕ ВАРИАЦИИ НА ОДНУ ТЕМУ
Мобильные диспергированные элементы — это далеко не единственный вид подвижных генов клетки. Есть еще и иные, устроенные по-другому. Во-первых, это хорошо изученный уже сейчас P-элемент генома дрозофилы, который был открыт несколько лет назад Дж. Рубиным (США). Это отрезок ДНК длиной около 2900 нуклеотидных пар, в котором закодирован белок транспозаза, фермент, способный вырезать куски ДНК и встраивать их в новые места генома. На концах Р-элемента находятся короткие «обращенные повторы», то есть одинаковые последовательности, ориентированные в противоположных направлениях на ДНК.
Фермент транспозаза узнает именно обращенные повторы и, узнав их, помогает «прыгать» P-элементу с места на место. Кстати, короткие обращенные повторы встречаются и у других мобильных элементов — и это помогает им тоже перемещаться по хромосоме с помощью транспозазы. Словом, P-элемент может инициировать прыжки как других генов, так и самого себя.
В клетках дрозофил обычно насчитывается несколько десятков копий P-элементов. Есть среди них дефектные копии, потерявшие часть исходных последовательностей. Такие копии уже не могут способствовать переносу других генов, так как в них испорчена запись о полноценной транспозазе. Но сами они все еще могут прыгать, коль скоро сохранили «обращенные повторы» на концах.
Очень похоже, по-видимому, устроены подвижные гены кукурузы — те самые, которые впервые были описаны в работах Барбары Макклинток. Гены эти были выделены в чистом виде лишь в 1982 г. методами генной инженерии двумя группами исследователей — П. Штарлингера (Кельнский университет) и Н. Федорофф (Институт Карнеги, г. Балтимор). Круг, таким образом, замкнулся.
Есть еще один вид подвижных элементов. Это так называемые «вездесущие» короткие повторы в геноме млекопитающих. Они на самом деле короткие — по 100—300 нуклеотидных пар. Открыли их у нас в лаборатории в геноме мыши и в США в геноме человека. И они на самом деле вездесущие. Две их разновидности (В1 и В2) встречаются в геноме по 100 000 раз! У мышей некоторые из этих копий порой немного отличаются друг от друга. У человека известен лишь один тип таких повторов (он назван Alu). Alu повторяется в генетическом аппарате человека 300 000 раз.
Словом, повторы эти необычайно множественны. Буквально, какой участок генома ни анализируешь, всегда в нем встречается «вездесущая» последовательность. Их природа оставалась совершенно непонятной, пока не определили их структуру. Оказалось, что В1, В2 и Alu обрамлены короткими «прямыми повторами» нуклеотидов. А это еще один вариант концевых повторов, обрамляющих любой подвижный элемент (о «длинных концевых повторах» и коротких «обращенных» повторах мы уже упоминали).
Сразу стало ясно, что «вездесущие повторы» — это не что иное, как мобильные элементы.
В аппарате наследственности насчитывается еще немало других подвижных участков. Останавливаться на них мы не будем. Главное, что хотелось отметить,— то, что мобильные элементы только поначалу казались экзотикой. Теперь их пооткрывали во множестве, каждый их вид встречается в геноме порой по сотне тысяч раз. И хромосомы буквально пестрят этим непременным элементом их устройства.
ЗАЧЕМ НУЖНЫ МДГ
Естественно, напрашивается вопрос — какова функция в клетке мобильных генов? В МДГ и провирусах ретровирусов бывает закодирован фермент ревертаза, переписывающий текст РНК в ДНК. Кроме того, они могут кодировать и белки, формирующие вирусные или вирусоподобные частицы. В P-элементе записана информация о тран-спозазе, нужной для его вырезания и встраивания в хромосому.
Иными словами, повторяющиеся генетические элементы несут в себе запись о белках, нужных самим подвижным генам для того, чтобы перемещаться или умножаться в числе. Поэтому наиболее распространенное сейчас толкование сводится к тому, что подвижные гены — это «эгоистическая» ДНК, или «генетические паразиты», основная задача которых — самовоспроизводство. Поскольку МДГ кодируют в своем тексте ферменты, которые обеспечивают им независимое от клетки размножение и внедрение в новые места, то этому балластному материалу удается противостоять давлению естественного отбора. Избавиться от них клетка не может.
Некоторые подвижные элементы, например короткие повторы, вроде бы не так уж и самостоятельны, они не кодируют белков, но зато они успешно используют клеточные белки и ферменты, продуцируемые другими подвижными генами, для своего размножения в геноме.
Воистину все это мертвый груз для клетки: если с помощью последовательных скрещиваний удалить из генома какой-нибудь мобильный элемент, то это никак не сказывается на жизнедеятельности клетки. На все мобильные гены приходится примерно пятая или четвертая часть синтезируемой клеткой РНК. То есть до четверти продукта идет на непроизводительные расходы. Многовато, но вытерпеть можно. Конечно, в случае, если подвижные гены размножаются сверх меры, клетка начинает страдать всерьез, однако обычно этого не происходит.
Другой принципиальный вопрос состоит в том, как сказываются на жизни клетки перемещения мобильных элементов. Вот тут ситуация далеко не безмятежная: подвижные гены, внедряясь в новое место генома, оказывают сильное влияние на работу соседних генов. Эффект тут может быть разным. Если МДГ попал в кодирующую часть гена, то изменяется запись, которую несет этот ген. Интересно, что большая часть спонтанных мутаций, то есть мутаций, распростра-
ненных в природных популяциях, есть результат внедрения в ген подвижных элементов.
Конечно, не всегда такие события оборачиваются мутацией. В некоторых случаях МДГ не затрагивает основную часть кодирующей последовательности гена и тот может сохранять свою функцию, но свойства его, хотя бы частично, могут меняться.
И еще одна типичная ситуация: подвижный элемент встраивается рядом с геном. Результат — изменения интенсивности работы последнего. В частности, может начаться постоянная и интенсивная транскрипция гена, попавшего под влияние промотора или усилителя, расположенного на концах МДГ. Может стать иной и регуляция работы гена.
Все эти события уже далеко не безразличны для клетки, они приводят к серьезным изменениям в работе ее генетического аппарата.
КАК ЧАСТО ПРЫГАЮТ ГЕНЫ
Сколь же часто перемещаются подвижные гены и не вызывают ли их перемещения хаос в работе клеточного хозяйства? Исследования, проведенные Е. Ананьевым и Ю. Ильиным, убеждают, что прыжки — это весьма редкие события, у мух дрозофил они происходят с частотой, не большей, чем 10—5 на поколение.
В хромосомах дрозофил, выведенных путем длительного скрещивания только родных братьев и сестер, не удается обнаружить различия в расположении МДГ-1 у разных особей.. Из поколения в поколение «узор» МДГ остается постоянным.
Однако в определенных условиях частота перемещений резко возрастает. Особенно ярко это проявляется при скрещивании неродственных между собой линий мух, например самцов P-линий, несущих упомянутый выше P-элемент, и самок М-линий, где Р-элемент отсутствует. В исходной линии самцов МДГ практически неподвижны, так как блокировано действие транспозаз, вырабатываемых подвижными генами.
Но вот произошло скрещивание, у самок М-линии в цитоплазме нет веществ, блокирующих транспозазу, и у потомства начинается усиленное блуждание Р-элементов — с частотой 10 минус 2 степени—10 минус 3 степени на клетку. Правда, в последующих поколениях подвижность мобильных генов постепенно снижается.
В Институте общей генетики АН СССР, в работах Т. Герасимовой, были получены интересные результаты. Она вывела мушек с крайне неустойчивой мутацией. (Мутация затрагивала ген cut и выражалась в обрезанной форме крыльев.) Неустойчивость мутации проявлялась в том, что у одной дрозофилы на тысячу восстанавливался нормальный внешний вид, что означало возвращение гена к нормальной работе. А иногда происходили мутации нового типа, в результате которых форма крыльев менялась ещё больше. Но и новые изменения были кратковременными, мушки быстро восстанавливали первоначальный вид.
Стали выяснять, в чем дело. Оказалось, что в ген cut попадает подвижный элемент МДГ-4. Но закрепляется он тут не навечно: довольно часто перепрыгивает на другое место, из-за чего мутировавший ген восстанавливает свои функции. Если же МДГ-4 перемещался в новое место в пределах того же гена cut, то менялся просто тип мутации.
В этих же опытах обнаружили удивительное явление. Я уже говорил, что у одной мухи из тысячи МДГ-4 перепрыгивал из гена cut в другое место. И именно у этих редких мух проявлялись новые неустойчивые мутации, связанные с работой других генов (контролирующих цвет глаз, форму щетинок и пр.), расположенных в совсем других частях хромосомы. Новые мутации были связаны с попаданием в эти гены других подвижных элементов. Иными словами, в одной и той же клетке одновременно перемещались сразу по нескольку МДГ.
Герасимовой удалось зарегистрировать одновременно до 20 перемещений разных генов. Но совершенно очевидно, что общее число подвижек в генетическом аппарате измерялось сотнями. Следовательно, в очень небольшом числе клеток одновременно происходили множественнее перемещения генов, что вызвало появление организмов с множественными отличиями от родителей. Это явление было названо «транспозиционными взрывами».
МДГ И ЭВОЛЮЦИЯ
Транспозиционные взрывы подсказывают новые идеи для понимания эволюции. В последнее время много говорят о необходимости скачкообразных изменений генетического аппарата в эволюционном процессе. Такую множественную скачкообразную «изменчивость» могут давать именно транспозиционные взрывы.
Под влиянием таких взрывов могут случайно возникнуть множественные изменения, обеспечивающие лучшую приспособляемость организмов к условиям среды.
Механизм транспозиционных взрывов остается пока неизвестным. P-элемент есть во всех клетках организма, но почему-то лишь в некоторых из них вдруг возникают массовые перемещения мобильных генов.
МОБИЛЬНЫЕ ГЕНЫ И РАК
Повторяющиеся генетические элементы играют определенную роль в появлении таких мутаций, которые ведут к раку. Сейчас уже ясно, что превращение нормальной клетки в опухолевую есть следствие активации особых клеточных генов, онкогенов. Эти гены кодируют белки, важные для роста и размножения клеток. Если их работа выходит из-под контроля регуляторных систем клетки, начинается злокачественное перерождение.
Онкогены могут быть активированы разными способами. Один из них — мутация гена, замещение одного или нескольких нуклеотидов, в результате чего меняются аминокислотные остатки в молекулах белка. Другой путь — рост числа онкогенов из-за ошибок при синтезе ДНК. Третий путь — усиление транскрипции онкогена и выход ее из-под контроля регуляторных механизмов клетки. Четвертый путь — такое изменение в гене, которое заставляет усиленно вырабатывать белок на РНКовой копии этого гена.
В третьем и четвертом случаях большая роль в активации онкогена как раз и принадлежит подвижным элементам генома. Внедрение МДГ (или ретровирусного провируса) может резко подхлестнуть работу соседствующего гена.
Когда подвижный элемент внедряется в ген, то изменение структуры гена может изменить и структуру его информационной РНК. Сейчас уже известны некоторые опухоли, возникновение которых прямо связывают с перемещением мобильных элементов.
Я уже говорил, что мы плохо пока понимаем регуляцию генных перемещений. Очевидно, что постижение этих механизмов имеет немаловажное значение в общей комплексной программе профилактики опухолевых заболеваний.
Прошло всего семь лет с тех пор, как была открыта, а точнее, переоткрыта способность генов к перемещению. Это событие заставило нас пересмотреть многие представления об устройстве генетического аппарата клетки. Появилась возможность увидеть подоплеку многих важных событий в ее жизни (спонтанных мутаций, злокачественного перерождения, особенностей эволюции). Не исключено, что список будет продолжен.